Contáctanos Síguenos
Suscríbete
Volumen 19, número 3
Sep / Oct 2022 . vol. 19 / núm. 3

Un método de lisis celular novedoso para mejorar el proceso de fabricación de vectores virales

En este artículo, los autores analizan una solución novedosa de lisis celular que es eficiente y genera poca espuma, haciéndola fácil de usar.

Por Arvind Srivastava

INVESTIGACIÓN ARBITRADA



Arvind Srivastava, Courtney O’Dell, Michael Hill, Lori Fortin, Jonathan Fura, William Connors, y Nandkumar Deorkar

El virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés) se ha convertido en una plataforma líder para la administración de genes para el tratamiento de varias enfermedades debido a su excelente perfil de seguridad y transducción eficiente a varios tejidos diana. Sin embargo, la producción a gran escala y el almacenamiento a largo plazo de vectores virales no son eficientes, lo que da como resultado rendimientos más bajos, pureza moderada y vida útil más corta en comparación con las terapias de proteínas recombinantes. La fabricación de AAV incluye varias operaciones unitarias de etapas anteriores del proceso, etapas posteriores del proceso y de llenado/terminado. La lisis celular es una de las operaciones unitarias clave en etapas posteriores del proceso, donde el límite exterior o la membrana celular se rompe o destruye para liberar el vector viral de la célula hospedera. Durante la lisis celular y la separación del vector viral de los restos celulares, los vectores virales están expuestos a una fuerte tensión de cizallamiento que agrega, despliega y precipita el virus. En este artículo, los autores analizan una solución novedosa de lisis celular que es eficiente y genera poca espuma, haciéndola fácil de usar. La nueva solución también protege al vector viral del daño inducido por cizallamiento durante el proceso de fabricación, lo que da como resultado un título mejorado del vector viral. La solución es ecológica y biodegradable.

Enviado: 18 de marzo de 2022
Aceptado: 31 de marzo de 2022


S
e han realizado avances tecnológicos significativos durante varias décadas que brindan opciones para tratar y controlar enfermedades que amenazan la vida. Uno de los avances más revolucionarios en esta nueva era es la terapia celular y génica. El éxito clínico de la terapia génica depende en gran parte de la administración eficiente del material genético a las células diana. Se han evaluado varios vectores virales diferentes y sistemas no virales para la administración de genes, incluyendo nanopartículas, liposomas, virus adenoasociados (AAV), lentivirus y adenovirus (1–2). En comparación con otros sistemas de administración para terapia génica (1–2), el AAV se ha convertido en el vector predominante debido a muchos atributos deseables, incluyendo una falta de patogenicidad, la infección eficiente de las células en división y las que no se dividen, y mantenimiento sostenido del genoma viral (3).

La fabricación del vector viral de AAV es un proceso complejo que requiere varias operaciones unitarias de etapas anteriores del proceso, etapas posteriores del proceso y de llenado/terminado (4). El procesamiento posterior es la etapa más compleja del proceso de fabricación porque es donde se pierde hasta el 70 % de los vectores virales durante el procesamiento (5). Por lo tanto, comprender y optimizar operaciones unitarias en el procesamiento posterior son cruciales para la fabricación rentable de productos de terapia génica (6). Una de las operaciones unitarias clave de etapas posteriores del proceso es la lisis celular, la cual requiere la liberación del vector viral de las células. La lisis celular se refiere a la ruptura de la membrana celular y la posterior descomposición de las células.

Existen varios métodos mecánicos y químicos para lisis celular (7). La técnica mecánica rudimentaria para liberar vectores recombinantes de AAV de las células son ciclos de congelación/descongelación seguido de un paso de clarificación por centrifugación a baja velocidad. Esta técnica no es apropiada para la purificación a gran escala de AAV, porque es difícil de escalar. La homogeneización mecánica es otro método de lisis en donde las células del medio se fuerzan a través de un orificio utilizando alta presión. La rotura de la membrana se produce debido a la gran fuerza de cizallamiento conforme la célula se somete a compresión mientras entra en el orificio y cuando se expande al descargarse. Aunque este método es escalable, tiene la desventaja de la pérdida de producto debido a la agregación y la precipitación inducidas por tensión de cizallamiento.

Los detergentes, tales como octoxinol-9 (también vendido como Triton X-100), desoxicolato de sodio y dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés), han sido utilizados como detergentes primarios para lisis celular (8). La lisis celular por SDS funciona solo a pH alcalino (9), el cual no es una condición de solución óptima para estabilidad de las partículas virales, así como otros constituyentes intracelulares (10). En el proceso de lisis celular por SDS, los vectores virales se liberan de las células hospederas en condiciones adversas de solución, lo que resulta en una pérdida significativa de vectores virales debido al procesamiento. Entre los métodos químicos, el Triton X-100 ha sido el detergente preferido para procesos de purificación de vectores virales debido a su desempeño (8). Sin embargo, la investigación ha demostrado que Triton X-100 causa toxicidad oral aguda, daño ocular, irritación de la piel y toxicidad acuática crónica (11). Como resultado, el detergente ha sido incluido en la "lista de sustancias extremadamente preocupantes" en diciembre de 2016 por la Agencia Europea de Sustancias Químicas bajo las regulaciones de Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas (REACH, por sus siglas en inglés) (11). REACH es un reglamento de la Unión Europea promulgado en diciembre de 2006 para abordar la seguridad química tanto para la salud humana como para el medio ambiente. El Triton X-100 ha sido prohibido para su uso en Europa desde enero de 2021, y otras regiones del mundo podrían seguir o sufrir los efectos de Europa (12).

Crea una cuenta o inicia sesión para leer todo el contenido, ¡es gratis!